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微生物学是一门实践性、技术性很强的课程，微生物学实验的方法是根据微生物独特的形态、生理、繁殖特征设计的。主要包含三大部分共十次实验内容，第一部分：微主物学基本操作技能。训练学生掌握微生物学最基本的操作技能，包括油镜的正确使用和显微镜维护、不同微生物的染色、运动、个体和群体形态观察比较、测微技术、培养和分离技术等；第二部分：综合提升实验，在掌握微生物学基本技能的基础上，训练学生独立设计和自主创新，培养学生观察、思考、分析问题的能力。第三部分：实验技能综合考试。该课程的目的：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；进一步了解、深化微生物学的基本理论，加深理解课堂讲授的有关微生物学理论知识，同时通过实验，培养同学观察、思考、分析问题和解决问题的能力，实事求是，严肃认真的科学态度，以及勤俭节约的优良品质。
1、 实验室内保持干净整洁，勿高声说话和随意走动，保持室内安静。
2、 进入实验室一定穿实验服，非必要物品禁止带入实验室。不准吸烟、吃喝东西、禁止用嘴移液或用未经清洗的手接触眼睛等。
3、 要严格按照实验室安全规程操作，避免或者减少气溶胶的产生。万一遇到操作不慎打破盛有菌的试管或三角瓶，皮肤划伤、微生物入眼或口等情况，应立即用清水先处理伤口并报告老师。
4、 对于泄露或污染的物品或者台面要进行消毒处理，使用75%的酒精进行擦拭。所有污染物要进行统一灭菌后倾倒。
5、 实验过程中女生长头发不允许披肩，最好束起来并盘到头顶。切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃易爆药品接近火焰。如遇危险，应保持冷静，先关掉火源，再进行有效的灭火处理。
6、 使用显微镜或其他贵重仪器，要求细心操作，特别爱护。对消耗品和药品要力求节约，用完后放回原处。
7、 每次实验进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于指定地点。实验室中的菌株和物品禁止私自携带外出。
8、 每次实验前必须充分预习，了解实验原理，做到心中有数，思路清楚。
9、 认真做好实验过程中的记录，实验报告必须使用统一的报告单。
10、 离开实验室前将手洗干净，注意关闭电源，门窗和灯等。
一、 实验目的
1、通过简单的棉塞的制作，训练学生左右手相互协调的能力，为微生物实验中的具体操作打下基础。
2、清洗实验器皿以及包装，让同学们理解微生物实验过程中无菌的概念，且这一概念贯串整个微生物学任何实验的过程中。
3、 让同学们理解例如培养皿、琼脂、接种针等简单的设计起到非常重要的作用。
二、 实验原理
1、 试管塞子或者是三角瓶塞子的作用原理。
2、 培养皿无菌培养的原理。
3、 琼脂在培养基中的作用原理。
4、 接种针的设计原理。
三、 实验材料、仪器和试剂
棉花，纱布，线绳，剪刀，培养皿，报纸，接种针，试管，三角瓶，灭菌锅。
四、 实验方法及步骤
棉塞制作的过程。
培养皿包装灭菌过程。
五、 注意事项
重在锻炼学生的动手能力和学习能力以及自我的思考能力。在实践中不断摸索不断学习的过程。结果不要求多而要求精。
六、 思考题
无
学习并掌握油镜的使用方法；
学习并掌握对细菌进行涂片染色的方法；
学习无菌操作技术。
二、 实验原理
1、细菌单染色和革兰氏染色的原理。
2、油镜的使用原理。
三、 实验材料、仪器和试剂
B1（枯草芽孢杆菌），B5（金黄色葡萄球菌），B7（大肠杆菌），螺旋菌（口腔），显微镜，培养皿，报纸，接种针，试管，三角瓶，灭菌锅，各种染色液等。
四、 实验方法及步骤
1、细菌的单染色
1.1 要求：分别制作B1和自身口腔牙垢螺旋菌涂片，染色并观察。
1.2 过程：涂片 → 干燥 → 固定 → 结晶紫染色（2分钟）→ 水洗 →干燥 → 镜检。
2、细菌的革兰氏染色
2.1 要求：制作B5和B7的混合涂片，染色并观察（B7比B5多涂一些）。
2.2 过程：涂片，干燥，固定 → 结晶紫染色（2分钟）→ 水洗 → 碘液（1分钟）→ 水洗 → 酒精（15秒）→ 立刻水洗 → 番红（2分钟）→ 水洗 → 干燥 → 镜检。
3、细菌的群体形态观察（菌落的大小、色泽、透明度、形状、边缘、突起程度）。
五、 注意事项
同学们操作过程中要注意的问题：
1) 涂片不能太多水？要涂开一些，如果有聚集的现象说明不干净，用去污粉洗干净后重新进行。
2) 图片不要太厚，要均匀，固定温度不能太高。（都要问为什么？）
3) 染料只要覆盖涂片的区域即可。
4) 为什么我们要采取混合图片的方式呢？强调对照的重要性。
5) 如何快速的定位自己要观察的对象。
6) 重点说明脱色的过程和如何把握脱色的过程。
六、思考题
1) 如何判断显微镜下视野中看到的东西是否是我们需要观察的对象？分析多种可能性，所得结论对应的依据是什么。
2) 怎样确定一株未知菌株是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，具体过程怎样进行？
3) 自己革兰氏染色过程结果分析？
一、 实验目的
1、掌握细菌大小的测微技术。
2、掌握细菌芽孢和荚膜的染色方法。
3、掌握细菌运动运动性的观察方法（悬滴法）。
二、 实验原理
1、对细菌大小进行测量的原理。
2、芽孢和荚膜的染色原理。
3、细菌运动性观察和判别的原理。
三、 实验材料、仪器和试剂
枯草芽孢杆菌（B1）、金黄色葡萄球菌（B5）、原核固氮菌，显微镜，载玻片，酒精灯，接种针，水，镜台测微尺，目镜测微尺，灭菌锅，各种染色液等。
四、 实验方法及步骤
1、细菌大小测微的实验
1.1 用镜台测微尺分别对低倍镜、高倍镜和油镜的目镜测微尺进行校正。
1.2 分别对B1、B5进行单染色。
1.3 在油镜条件下，用目镜测微尺分别对B1、B5进行观察和测量（选五个不同的菌体取其平均值）。
2、细菌的芽孢染色实验
涂片、干燥、固定，加数滴孔雀绿染液于玻片上，微火加热至燃料冒蒸汽并维持，计时5分钟，待玻片冷却后水洗，蕃红复染2分钟，然后水洗，干燥，镜检。
3、荚膜染色法
用结晶紫单染色法对原核固氮菌进行染色（涂片稍厚，不能加热进行干燥和固定，稍水洗），镜检时菌体细胞外一圈透明区域即为荚膜。
4、用悬滴法观察细菌的运动性
4.1 分别取1环B1和B5的滴悬液于盖玻片上，翻转后覆于凹玻片上。
4.2 镜检：用低倍镜找到液滴的边缘，后移至高倍镜下观察菌体的运动性（视野光线要调暗）。
五、 注意事项
1) 芽胞染色时染料在加热的过程中不能干，同时也不能太多导致流动地到处都是。示范一下操作。
2) 拿到水池旁边。加热完冲水前一定要冷却一会，要不热胀冷缩导致玻璃炸裂。
3) 荚膜染色时涂片不能用火固定。
六、 思考题
1) 用简单染色是否可以观察到细菌的芽孢？原因是什么？
2) 芽孢染色过程中只是大量的游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？
3) 如何判断视野中观察到的细胞是在运动还是在做布朗运动？判断的依据是什么？
6) 描述B1和B5的运动特征，并判断其是否具有鞭毛结构。
7) 在芽孢染色时，当用孔雀绿对菌体染色后，为什么不能立即水洗？
一、 实验目的
学习霉菌和放线菌个体形态以及群体形态的观察。霉菌形态相比于细菌更为丰富，是分类的重要依据。从菌丝的形态，孢子的形态，孢子梗的形态和长度等，孢子的形态，大小，表面结构或者颜色等都能够区分不同的霉菌，因此认识了解霉菌形态是分类的重要依据。
1.学习并掌握观察放线菌、霉菌个体形态的基本方法
2.观察不同放线菌、霉菌的形态特征
二、 实验原理
1、 放线菌（原核微生物）由菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为三个部分：营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。孢子丝由气生菌丝分化形成，呈螺旋状，波浪形或分支状等。
2、 霉菌是一类可产生复杂分支菌丝的真核微生物的统称。菌丝体也同样分为三个部分：营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。孢子丝生长到一定阶段分化产生。霉菌菌丝和孢子的宽度通常要比放线菌大。
三、 实验材料、仪器和试剂
白色链球菌A2、兰色链球菌A9、根霉F1、青霉F7、曲霉F9，显微镜，载玻片，酒精灯，接种针，水，培养皿，接种针，试管，三角瓶，灭菌锅，各种染色液等。
四、 实验方法及步骤
1.对放线菌个体形态和群体形态的观察
1.1 将用扦片法培养好的放线菌扦片放于载玻片上，观察菌丝
1.2 用印片法观察放线菌的孢子丝和孢子
1.3 观察放线菌的群体形态，包括质地、大小、色泽、突起程度、形态、
气味、湿润程度等。
2.对霉菌个体形态和群体形态的观察
2.1 描述F1、F7、F9菌群的形态（大小、菌丝、孢子、正反面色泽、湿
润程度等）
2.2 对F1的观察
2.2.1 将F1平板直接置于载物台上，用低倍镜观察其假根、匍匐丝、孢子梗、孢囊等。
2.2.2 取F1菌丝作透明剂浸片，进一步观察其形态
2.3 对F7观察
取F7菌丝作透明剂浸片，观察其帚状根形态
2.4 对F9观察
取F9菌丝作透明剂浸片，观察其足细胞、分生孢子梗、分生孢子等。
五、 注意事项
六、 思考题
1) 你根据那些特征来区分我们观察的三种霉菌和两种放线菌？
2) 镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
一、 实验目的
1.观察酵母的形态及生殖方式
2.区分酵母死活细胞的方法
3.学习并掌握用血球计数板对细胞进行直接计数的方法
二、 实验原理
1.区分酵母死活细胞的方法原理
2.用血球计数板对细胞进行计数的原理
三、 实验材料、仪器和试剂
酿酒酵母（S6）、解脂假丝酵母（S5）、血球计数板，显微镜，载玻片，酒精灯，接种针，水，盖玻片，培养皿，接种针，试管，三角瓶，灭菌锅，各种染色液等。
四、 实验方法及步骤
1.酿酒酵母个体形态观察
1.1 作S6美兰溶液浸片，观察酵母的颜色、形态及分芽细胞
1.2 放置5分钟后，再观察酵母的颜色，判断死活细胞
2.解脂酵母个体形态观察
作S5水浸片，观察S5形态
3.酿酒酵母子囊孢子观察
作S6水浸片，观察其子囊孢子形态及数量
4.观察并记录酵母菌群体形态特征
5.用血球计数板对酵母悬浮液进行技术（以稀释100倍）
5.1 先用×10、×40物镜观察并熟悉计数板构造（计数室、中方格、子方格）
5.2 加菌悬液并计数
5.3 计算出稀释前酵母菌悬液的数量
五、 注意事项
六、思考题
1) 画出观察到的酵母形态
2) 描述酵母的群体形态特征
3) 计算出酵母菌悬液的数量
4) 酵母的繁殖方式有哪些？讨论实际情况下大多数酵母的繁殖方式是什么？
5) 是否可以用血球计数器直接计数金黄色葡萄球菌并说明原因？请至少说出两种可以获得培养物菌体数目的方法。
6) 是否所有的不同颜色的物质都可以用来判断细胞的死活？为什么？作为一个死活细胞细胞监测的试剂的条件有哪些？
首先，氧化态和还原态得有明显区别。其次，细胞毒性不能太大。再次，还原后要能够便于观察。
1、学生学习培养基的配制原则和方法，加强对微生物营养章节的学习内容的理解。
2、 了解掌握不同灭菌方法及其相应的原理。了解不同灭菌方式的适用范围。对比消毒的概念，理解两者之间本质的区别。
二、 实验原理
1、 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最为广泛，最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源，磷酸盐和维生素。蛋白胨主要提供氮源和维生素，而氯化钠提供无机盐。配制固体培养基时，还需要加入一定量的琼脂作为凝固剂。由于这种培养基多用于细菌培养，因此，要用稀酸或稀碱将其pH值调至中性或微碱性，有利于细菌的生长繁殖。
2、 高氏一号培养基是用来培养和观察防线菌形态特征的合成培养基，如果加入适量的抗菌药物，则可用来分离各种放线菌。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。如培养基中的磷酸盐和镁盐相互混合时容易产生沉淀，因此在混合培养基成分时，一般按照配方的顺序依次溶解的成分，甚至有时还需要将两种或者多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。此外，合成培养基有的还需要不加微量元素。
3、 马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基使用葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、孟加拉红以及链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源。磷酸二氢钾和硫酸镁作为无机盐为微生物提镁、钾、磷等离子。这种培养基的特点是培养基中加入孟加拉红和链霉素能有效抑制细菌和放线菌的生长，而对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。
不同灭菌方法及其相应的原理。
三、 实验材料、仪器和试剂
盖玻片，培养皿，接种针，试管，三角瓶，灭菌锅。
四、 实验方法及步骤
1.配置牛肉膏蛋白胨培养基
1—6组，每两组配500 ml（80 ml一瓶） 7—8组，每组配400 ml（100 ml一瓶）
2.配置高氏I号培养基
9—10组，共1.5 L （80 ml一瓶）
3.配置马丁氏培养基
11—12组，每组配400 ml （80 ml一瓶）
4.伊红美蓝培养基
13-14 组，总共700 ml （100 ml 一瓶）
五、 注意事项
1）演示移液器的使用。
2）配置溶液的基本原则-浓度篇，总量强调。
3）强调使用的试剂与配方之间的对应关系。
4）强调做饭过程中的顺序很重要。（淀粉溶解的过程提示）
5）配置过程先做一锅还是分碗做？有什么差别？
六、思考题
1) 设计培养基的4个原则和4个方法是什么？你能提出来更好的原则和方法吗？（周德庆微生物学参考）
2) 灭菌条件设定的标准是什么？灭菌的方法有哪些？举例说明其适用范围？
3) 如果你需要配制一种含有一种抗生素的牛肉膏蛋白胨固体平板培养基100 mL，其抗生素的工作浓度是50 μg/mL，你将如何做？
4) 现有万分之一天平一台（已经较高精度了），现需要配制含有量为0.0005mg的合成培养基100 mL，请问你如何量取FeCl3？讨论精确程度如何？
一、 实验目的
1，学生掌握常用的分离纯化的基本操作技术。
2， 从根本上练习掌握无菌操作技术。
二、 实验原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面：①选择合适于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。②微生物在固体培养基上形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可以通过挑取单菌落的方法获得一种纯培养物。获取单个菌落的方法可以通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。纯培养的确定除观察其群落特征外，还需要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极为丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。
三、 实验材料、仪器和试剂
取土铲，培养皿，三角瓶，天平，移液器，移液管，接种针，无菌水，试管，玻璃刮叉，烘箱，灭菌锅。
四、 实验方法及步骤
1.用稀释涂布培养法分离微生物
1.1 倒平板：将高氏I号和马丁氏培养基分别加热融化并冷却至55℃—
60℃，其中向高氏I号加入10%苯酚0.15 mL向马丁氏中加入0.03%链霉素
10ml，混匀后分别倒平板（其中高氏I号倒4个，两个用于划线分离；马
丁氏倒2个）
1.2 制备10-1至10-7不同稀释度的土壤溶液
1.3涂布分离：用吸管从10-4、10-5稀释液中分别吸0.1 mL液体放入上
述平板中（每个稀释度加1个平板），用刮叉均匀涂布，于28℃倒置培养。
2.用划线法分离微生物
2.1 制备不同稀释度的培养液（用1.2）
2.2 从10-2土壤稀释液中取1环土壤悬液于2个高氏I号培养基平板上划
线，于28℃倒置培养。
3.用倾注法倒平板分离微生物并进行计数
3.1 制备土壤悬液
3.2 融化牛肉膏蛋白胨培养基，并冷却至50℃左右待用
3.3 从10-6，10-7土壤稀释液分别取0.1 mL悬液，加入平皿内，将冷却
至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基倒入平皿内，轻轻摇动平皿，使悬液均
匀分布于培养基中，待凝后于37℃倒置培养。
五、 注意事项
培养基弄破
污染
倒培养基太多或者太少
取样前一定混匀。
六、思考题
1) 讨论为什么用牛肉膏蛋白胨培养基在不加任何其他物质的情况下可以分离细菌？
2) 如何确定平板上你分离得到的单菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。
一、 实验目的
了解水样采样方法和细菌总数的测定方法。
了解平板菌落计数的原则。
二、 实验原理
应用平板菌落计数测定水样的细菌总数的方法。由于水中的微生物种类较多，他们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下培养水中的所有的细菌，因此，以一定的培养基平板上可以生长出来的菌落，计算出水中细菌总数仅仅是一种近似的方法。
三、 实验材料、仪器和试剂
培养皿，三角瓶，量筒，移液器，移液管，接种针，无菌水，试管，玻璃刮叉，灭菌锅等。
四、 实验方法及步骤
1、测定自来水中细菌总数
1.1 现将自来水龙头用火焰灼烧3分钟，再开水龙头，使流水5分钟后，已灭菌的三角瓶取水样，以待分析。分别取1 mL水样加入2个平皿内，再倾注溶化并冷却至45℃（约15ml），轻摇，使水样与培养基充分混匀。
1.2 另取1空的培养皿，倾注肉汁胨培养基（作对照）。
1.3 倒置于37℃培养24小时，进行菌落计数。
五、 注意事项
注意无菌操作规范性，避免引起污染导致结果不准确。
六、思考题
1) 为什么要检测水？怎样判断是否合格？指示菌株的选择标准需要符合那些要求？
2) 依据多管发酵的具体原理，讨论假如水中分别有大量致病菌-霍乱弧菌或者志贺氏菌，用多管发酵法是否可以检查大肠杆菌菌群，能否得到阴性结果？为什么？
一、 实验目的
学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。
了解大肠菌群的数量在饮用水中的重要性。
二、 实验原理
1、多管发酵法包括初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
1.1初步发酵试验，发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉式小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，还大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为了便于观察细菌的产酸情况，培养基内加溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后培养基由原来的紫色变为黄色，溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气。此外，产酸不产气也不能完全说明是阴性结果。少数情况下，也可能延迟48小时后才产气，此时应视为可疑结果。因此，以上两种结果均需要做下面的两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。
1.2平板分离试验，伊红美兰琼脂培养基中亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可以抑制其它杂菌的生长。伊红美兰琼脂平板还有伊红和美蓝染料，在此作为指示剂。大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料结合成复合物，使大肠菌群产生带金属光泽的深紫色菌落。
1.3复发酵试验，以上大肠菌群阳性菌落经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实，原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、 实验材料、仪器和试剂
伊红美蓝培养基，小套管，大套管，三角瓶，无菌水，玻璃平皿，接种针，移液器，试管，移液管，显微镜，灭菌锅，载玻片，染色液等。
四、 实验方法及步骤
1、测定自来水中大肠杆菌的数量
1.1初级发酵试验：在2个含有50 mL 3倍浓缩的乳糖发酵液的锥形瓶中，各加入100 mL水样，另外，在每个试管中加入10 mL水样，混匀后于37℃培养24—48小时。
1.2、平板分离 经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管或三角瓶分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上，在37℃下培养18-24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。
①深紫色，有金属光泽；②紫黑色，不带或略带金属光泽；③淡紫红色，中心颜色较深。
1.3复发酵试验，经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一发酵管的同类型菌落1-3个。37℃培养24小时，若既产酸又产气，就证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据发酵试验的阳性管（瓶）数查表XV-2，即得大肠菌群数。
五、 注意事项
注意无菌操作规范性，避免引起污染导致结果不准确。
六、思考题
1) 为什么要检测水？怎样判断是否合格？指示菌株的选择标准需要符合那些要求？
2) 依据多管发酵的具体原理，讨论假如水中分别有大量致病菌-霍乱弧菌或者志贺氏菌，用多管发酵法是否可以检查大肠杆菌菌群，能否得到阴性结果？为什么？
一、 实验目的
考核学生经过一个学期的训练是否能够独立进行基本微生物操作和基本微生物的区分。
二、 实验原理
无
三、 实验材料、仪器和试剂
显微镜，菌株，载玻片，盖玻片，培养皿，三角瓶，移液器，移液管，酒精灯，接种针，各种染料等。
四、 实验方法及步骤
学生每个人依次通过观察不同显微镜下样片，确定该微生物为哪类微生物的什么具体结构等。
选择一个微生物分离的方法进行具体操作。
五、 注意事项
学生互相不能交流。
显微镜下样片需要不断更换。
学生操作过程需要老师作为评判给出总体评价分数。
六、思考题
无。
附件：微生物实验.docx
